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[UE 1] Protides | chromato | applications des chromato(Tuteurs remerciés)

Question

...
lapinou
Membre
Médecine Montpellier
Bonjour ! heureux

Je ne comprends pas les différentes subtilité de sortes de chromatographie que M.Lehmann expose dans son cours, notamment la chromatographie ionique et la chromatographie d'exclusion selon les différentes conditions: dénaturant/non dénaturant/dénaturant + réducteur... neutre


Par lapinou le 07/10/2013 à 12h17 - Avertir les modérateurs Non respect de la charte

Réponses

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Yasmin
Tuteur simple
Médecine Montpellier
Salut lapinou,

Je pense que tu confonds chromatographie et électrophorèse... je m'explique :

Dans la chromatographie d'exclusion (voir diapos 26/84 et 62/84), le critère de séparation des différentes protéines va être leur taille et leur forme.
Plus concrètement en quoi consiste cette chromatographie ?
En fait tu fais passer une solution contenant des protéines, à travers une résine qu'on pourrait modéliser comme des billes comportant des pores d'un diamètre connu (par exemple qui ne laissent passer que les protéines d'un poids moléculaire < 100 kDa). Lors du passage des protéines dans la résine, il y en a qui sont trop grosses pour traverser les pores de la résine (donc dans mon exemple, qui ont un PM > 100 kDa), et d'autres qui sont assez petites pour traverser les pores (ont un PM < 100 kDa dans mon exemple). Par conséquent, les plus grosses protéines ont en quelques sortes "un trajet plus court à parcourir", elles sont donc éluées en premier (schéma diapo 62/84).

Maintenant le principe de la chromatographie ionique : (diapos 43 et 44/84)
Ici ton critère de séparation va être la charge.
Si on résume le principe : tu fais passer une solution dans une résine chargée, tout en faisant varier le pH de la solution (donc en faisant varier la charge des acides aminés). Prenons un exemple où la résine est chargée + : ce sont les acides aminés chargés - qui vont être retenus, et les AA chargés + qui vont être élués.

Pour expliquer plus en détail, je vais prendre un exemple de résine chargée +. On appelle la colonne utilisée "colonne échangeuse d'anions" ou "colonne anionique". Je me place au départ à un pH haut, donc mes AA sont chargés - (car les fonctions NH3+ et COOH sont dissociées en NH2 et COO-)

Donc au départ tous mes AA sont retenus car ils sont tous chargés -
Ensuite je diminue le pH petit à petit. La charge des AA change de signe quand le pH de la solution devient égal à leur pHi. (charge devient nulle puis positive) donc les AA ne sont plus retenus dans la colonne, ils sont élués.
Par conséquent, tu récupères au fur et à mesure des AA de pHi décroissant.

Je t'invite à réfléchir au cas inverse où on utiliserait une colonne échangeuse de cations (colonne chargée -). Tu aurais cette fois-ci un ordre d'élution dans le sens des pHi croissants.

Maintenant j'en viens aux conditions : non dénaturantes, dénaturantes, dénaturantes + agent réducteur. (reporte-toi à la diapo 64/84)

Ce sont des conditions qui sont utilisées pour réaliser des électrophorèses et non des chromatographies.

Ce que tu dois retenir :
- en conditions non dénaturantes ( = conditions natives) : la structure de ta protéine n'est pas modifiée.

- en conditions dénaturantes (en présence de SDS pour reprendre l'exemple le plus fréquent) : tu casses les liaisons faibles impliquées dans la structure de la protéine (liaisons hydrogène, interactions électrostatiques, et hydrophobes) donc en fait tu casses les liaisons entre les monomères (= sous-unités). On sépare les monomères dont cette protéine est constituée.
CONCLUSION : Quand on fait agir du SDS sur une protéine, on obtient ses monomères.

- en conditions dénaturantes + agent réducteur (SDS + β-mercaptoéthanol) : tu casses les liaisons entre les monomères ET les ponts disulfures. Tu sépare les différentes chaînes peptidiques dont sont constitués les monomères.
CONCLUSION : Quand on fait agir du SDS + β-mercaptoéthanol sur une protéine, on obtient des chaînes peptidiques.

Pour vérifier si tu as bien compris, je te conseille de faire le QCM 2 du TD 5.
(Et de venir à la super séance n° 5 que tes tuteurs adorés ont préparée !!)

Pour les différences entre conditions dénaturantes / non dénaturante / dénaturantes + agent réducteur, il faut bien avoir compris ! C'est difficile au début, et il faut se creuser la tête, mais une fois qu'on a compris il faut le voir comme un jeu !

J'espère avoir pu t'aider, et n'hésite pas à relancer si tu n'as pas tout compris, ou à passer en salle tuto. Expliquer avec des petits dessins c'est toujours plus fun et plus efficace rire

Bon courage !

Yasmin ABDERRAZIK
Tutrice simple en UE1 - TIG

Par Yasmin le 07/10/2013 à 13h09 - Avertir les modérateurs Non respect de la charte
...
Yasmin
Tuteur simple
Médecine Montpellier
Autre petite précision concernant l'utilisation du SDS (agent dénaturant) :

Comme l'a expliqué M. Lehman à l'oral (diapo 64/84 vidéo du 30/09 à 5 min), le SDS permettant d'entourer la protéine de charges -, cela permet à toutes les protéines d'être chargées de manière identique. Par conséquent la différence de distance de migration ne sera due qu'à une différence de poids moléculaire, et pas à une éventuelle différence de charges.

Yasmin ABDERRAZIK
Tutrice simple en UE1 - TIG

Par Yasmin le 07/10/2013 à 13h16 - Avertir les modérateurs Non respect de la charte
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lapinou
Membre
Médecine Montpellier
Merci pour cette réponse rapide et très claire, vraiment !
heureux heureux heureux
Par lapinou le 08/10/2013 à 22h33 - Avertir les modérateurs Non respect de la charte

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